Sci Adv︱多重荧光原位RNA杂交链式反应技术揭示斑马鱼幼体大脑基因表达图谱

撰文︱杨   思

责编︱王思珍，方以一

编辑︱王思珍

多重荧光原位RNA杂交链式反应技术（multiplexed fluorescent in situ RNA hybridization chain reaction（HCR）technology）是一种空间转录组学方法，具有高度敏感性、特异性和多路复用性，允许在具有不同探针特异性荧光团的样本中观察多种RNA种类的表达情况。然而，此前对于斑马鱼的研究大部分数据是在早期发育阶段（受精后长达72小时）收集的[1,2]，且利用的比色RNA原位杂交技术无法提供细胞分辨率或空间精度基因表达信息。

2023年2月22日，来自德国马克斯·普朗克生物智能研究所的HerwigBaier教授团队在Science Advances 上发表了题为“A single-cell resolution gene expression atlas of the larval zebrafish brain”的资源型论文，作者使用优化后的HCR技术构建了整个幼体斑马鱼大脑的空间层面的单细胞分辨率基因表达图谱。深入研究了使用即时早期基因cfos的事后HCR标记后，自由游动幼体大脑在猎物刺激和食物摄入下的反应活动图；揭示了除了先前描述的视觉和运动区域外，第二味觉核（SGN，secondary gustatory nucleus）中的一组神经元表达calb2a以及特定的神经肽Y受体，并投射到下丘脑。最后，作者将该数据被注册到Max Planck斑马鱼大脑（mapzebrain）地图集上，所有数据都是公开的，可以通过mapzebrain网站免费下载（ https://mapzebrain.org/）。

首先，该研究团队优化并构建了一个HCR原位标记的实验流程，并将数据注册到mapzebrain官方网址上（图1）。作者首先获得了 290 个基因的 FISH 数据，这些基因之前被确定为视网膜、顶盖和间脑中细胞类型特异性的标记。这些标记基因包括编码转录因子的基因、细胞表面和分泌分子、参与递质合成和运输的酶、神经肽和钙结合蛋白等。对于每个标记基因，作者对三只受精后6天的斑马鱼进行了标记和成像，并将其登记到标准脑中并取其平均值，以确保在动物之间映射出一致的表达信号。作者还对每个样本的两个基因进行多路复用，并以单细胞分辨率获取共聚焦数据，揭示每个感兴趣区域（ROI，region of interest）表达特定基因的细胞数量和任何重叠的表达。所有单个标记基因的表达模式，包括在单个大脑和平均大脑中的表达模式，都可以通过最新版本的mapzebrain公开访问，网址是http://mapzebrain.org/。

图1幼年斑马鱼大脑的基因表达图谱

（图源：Inbal Shainer, et al., Science advances, 2023）

接下来，作者研究了经历自由游动后cfos标记的斑马鱼脑活动图，其中cfos基因也被称为fosab，会在长时间去极化后在神经元中表达，通常被用作整合近期神经元活动的标记。作者将幼年斑马鱼置于不同的条件：（1）暴露在高温（32℃）；（2）暴露于低温（22℃）；（3）允许猎取猎物；（4）置于黑色背景上；（5）置于白色的背景上；（6）置于漂移的黑白光栅下来诱发视运动反应；（7）置于白色背景上的黑盘上，从而诱发了一系列的视觉逃避反应；（8）暴露在不对称的光源下诱发光轴；（9）暴露在报警物质“Schreckstoff”下（图2）。对于每个条件，作者对六个幼年个体进行了成像、登记和分析，并对cfos FISH标记的区域进行定性检查，观察不同条件下的特定活动热点区域。这种活动图不仅在很大程度上证实了以前发表的嵌入动物（embedded animals）的钙成像研究，而且还揭示了以前未识别的热点区域。例如，在猎取猎物的个体中，作者观察到前视神经节和视网膜第7区域（AF7，rborization field 7）有强烈的cfos标记，这两个区域被认为在嵌入和自由游动的鱼类中都涉及猎物探测和猎物捕获的启动，以及位于小脑桥附近的SGN的细胞中也观察到了强烈的cfos标记。

图2 cfos标记的斑马鱼脑活动图

（图源：Inbal Shainer, et al., Science advances, 2023）

最后，作者对与狩猎有关的脑区的分子和细胞进行分析。作者首先结合mapzebrain图谱、多重HCR FISH实验、三维ROI发现了cfos和calb2a的共同表达（图3）。此外，还发现编码神经肽Y（NPY）受体的npy1r也与SGN相关的cfos模式重叠。NPY与食物消耗和觅食的调节有关，npy1r的表达表明NPY可以通过直接向SGN神经元发送信号来调节味觉通路。作者再使用mapzebrain的搜索功能，确定了32个神经元，它们的细胞体在三维ROI内，再使用NBLAST算法发现SGN神经元的一个组（第4组）将轴突延伸到侧下丘脑的背区，该区域在对猎物刺激和饱腹感的反应中被激活[3]，并且在狩猎行为后也显示出强烈的cfos表达。因此，探索cfos活动图与形态学上重建的神经元揭示了SGN、AF7相关的前脑、中脑和后脑之间的联系，这些脑区在追逐和消耗猎物时共同参与（图3）。

图3 涉及猎物捕获的SGN神经元标记基因表达和可能的连接模式

（图源：Inbal Shainer, et al., Science advances, 2023）

文章结论与讨论，启发与展望

综上所述，作者绘制了一个全脑、单细胞分辨率的空间基因表达图，为幼年斑马鱼的神经科学资源提供了一个重要的补充；提供了幼年斑马鱼几种常见研究行为的cfos脑活动图，便于研究在不同环境条件下机体不同部位做出的反应；成功地将cfos地图与其他数据模式联系起来，如基因表达和单细胞连接（single-cell connectivity），帮助发现与行为有关的途径，例如，Calb2a+ SGN神经元在狩猎期间被味觉线索激活。未来工作的方向是将全脑功能成像数据（如钙离子或电压记录）和电子显微镜重建并纳入mapzebrain图谱。

原文链接：https://www.science.org/doi/10.1126/sciadv.ade9909 

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参考文献（上下滑动查看）  [1] B. Thisse, C. Thisse, Fast release clones: A high throughput expression analysis. ZFIN Direct Data Submiss. (2004).[2] C. Thisse, B. Thisse, High resolution whole-mount in situ hybridization. Zebrafish Sci. Monit. 5 (1998).[3] A. Muto, P. Lal, D. Ailani, G. Abe, M. Itoh, K. Kawakami, Activation of the hypothalamic feeding centre upon visual prey detection. Nat. Commun. 8, 15029 (2017).

本文完